Как определить концентрацию хлорофилла в листике растения Экспереметальным методом?

Методика спектрофотометрического определения хлорофилла а

Метод определения концентрации хлорофилла а при помощи флуориметра на основе мощных светодиодов


1. Методика спектрофотометрического определения хлорофилла а

В основе метода – спектрофотометрирование экстракта пигментов до и после его подкисления раствором соляной кислоты. Для приготовления экстракта пробу воды фильтруют через мембранный фильтр с нанесенным на нем слоем углекислого бария или магния, осадок размельчают (гомогенизируют), пигменты экстрагируют водным ацетоном из гомогената.


Порядок проведения анализа состоит из нескольких этапов:


1. Гомогенизация и экстрагирование. Слой ВаСO3, содержащий отфильтрованную взвесь, снимают скальпелем с мембранного фильтра и количественно переносят в механический гомогенизатор. После добавления туда же нескольких кубических сантиметров 90 %-ного ацетона в течение 1 мин взвесь растирают. Для экстрагирования пигментов гомогенат в течение 30 мин выдерживают при комнатной температуре. Полученный экстракт сливают в центрифужную пробирку. Осадок повторно растирают в гомогенизаторе в течение 1 мин при добавлении новой порции 90 %-ного ацетона. Через 30 мин вторую порцию экстракта вместе с осадком сливают в ту же центрифужную пробирку. Остатки экстракта и взвеси со ступицы и пестика смывают минимальным количеством 90 %-ного ацетона и также сливают в центрифужную пробирку с экстрактом. Взвесь, осажденную на фильтр из стекловолокна, допускается гомогенизировать вместе с фильтром. В этом случае следует использовать гомогенизатор со сферическими рабочими поверхностями.


2. Центрифугирование. Светорассеивающую взвесь удаляют из экстракта центрифугированием при 4000 - 5000g в течение 15 мин. Чистота экстракта контролируется по оптической плотности на 750 нм. Последняя не должна превышать 0,005Б на каждый сантиметр рабочей длины кюветы. При более высокой плотности центрифугирование следует повторить. После центрифугирования экстракт следует перенести в стеклянную мерную пробирку, при необходимости, добавляя 90 %-ный ацетон, довести его объем до объема фотометрической кюветы и закрыть пробирку притертой пробкой.


3. Спектрофотометрирование и подкисление экстракта. При спектрофотометрировании используются кюветы с рабочей длиной от 0,5 до 5 см в зависимости от объема экстракта и его оптической плотности. Отсчеты оптических плотностей берутся на четырех длинах волн - 664, 647, 630 и 750 нм. Фотометрирование проводится дважды: до и после подкисления экстракта несколькими каплями приготовленного раствора соляной кислоты в ацетоне. После добавления кислоты экстракт необходимо перемешать в течение 2 - 3 мин. При фотометрировании подкисленного экстракта отсчеты берутся на двух длинах волн 664 и 750 нм. Диапазон определяемых концентраций хлорофилла а, для которого устанавливаются пределы допускаемой погрешности определений, выполняемых по данной методике, составляет от 0,05 мг/м3 до любых максимальных значений, встречающихся в природных водах. Расчеты концентрации хлорофилла а основаны на известных удельных спектральных показателях поглощения света хлорофиллом а и основными компонентами, мешающими анализу (ГОСТ 17.1.4.02-90).

Второй метод здесь :

http://atlas.ssc-ras.ru/corgbook/methods/md-chla.html